1.为什么要进行菌种保藏

为了使所获得的药用真菌菌种在较长时间内保持其生活力、优良种性及纯正性，降低退化速度、防止污染，则需要采取一些技术措施，加以妥善保藏。

菌种保藏的方法很多，但其保藏原理基本相同，即造成一个低温、冷冻、干燥、缺氧的特殊环境条件，保藏菌种的菌丝体或孢子处于休眠状态，抑制其生长发育，既保持最低的代谢活动，又能保证其生命延续。 任何菌种保藏方法，都不能绝对保证菌种不退化，永远保持其优良种性；在菌种转管和培养过程中，造成的机械损伤等不良影响是不可能完全避免的。

因此，母种第一代转管尽量多接一些试管，尤其是生产中常用的一些优良菌株，将转接的试管采用不同方法保藏；用时取出一支活化后大量繁殖用作母种，生产完这批菌种或转接2~3代后，不再用这支菌种的后代。下次生产再从保藏母种中取一支繁殖，这样可减少母种传代次数，但保藏的母种到一定时间也需要转接；一般母种转接3~4代后就必须采用孢子分离方法进行菌种复壮。

2.经常使用的细菌菌株用哪种保藏方法比较好

1.斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。

保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。

此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。

（北纳生物）2.液体石蜡保藏法 （1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1.05kg/cm2>,121.3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。（2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。

（3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。（4）将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。

此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1—2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。

此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。

从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。3.滤纸保藏法 （1）将滤纸剪成0.5*1.2cm的小条，装入0.6*8cm的安瓿管中，每管1—2张，塞以棉塞，1.05kg/cm2>,121.3℃灭菌30分钟。

（2）将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。（3）取灭菌脱脂牛乳1—2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。

（4）用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。（5）将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。

（6）将棉花塞入管内，用火焰按图Ⅶ-13熔封，保存于低温下。（7）需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。

细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14—17年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。

4.沙土保藏法 （1）取河沙加入10%稀盐酸，加热煮沸30分钟，以去除其中的有机质。（2）倒去酸水，用自来水冲洗至中性。

（3）烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。（4）另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。

（5）烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒。（6）按一份黄土、三份沙的比例（或根据需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）掺合均匀，装入10*100mm的小试管或安瓿管中，每管装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌，烘干。

（7）抽样进行无菌检查，每10支沙土管抽一支，将沙土倒入肉汤培养基中，37℃培养48小时，若仍有杂菌，则需全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用。（8）选择培养成熟的（一般指孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种，以无菌水洗下，制成孢子悬液。

（9）于每支沙土管中加入约0.5ml（一般以刚刚使沙土润湿为宜）孢子悬液，以接种针拌匀。（10）放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，抽干时间越短越好，务使在12小时内抽干。

（11）每10支抽取一支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土管有问题，尚须进一步抽样检查。（12）若经检查没有问题，用火焰熔封管口，放冰箱或室内干燥处保存。

每半年检查一次活力和杂菌情况。（13）需要使用菌种，复活培养时，取沙土少许移入液体培养基内，置温箱中培养。

此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好，可保存2年左右，但应用于营养细胞效果不佳。5.液氮冷冻保藏法 （1）准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75*10mm的，或能容1.2mm液体的。

（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，1.05kg/cm2,121.3℃灭菌15分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10%的甘油蒸馏水溶液或10%二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用1.05kg/cm2>,121.3℃灭菌15分钟。（3）接入菌种将菌种用10%的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的。

3.

最勤勉-酵母菌：楼上几位也提到了，酵母菌可能是众多食品行业应用最广的了，天天不停的为我们制造啤酒、面包、药物、饲料等；最聪明-病毒类：我觉得可以把病毒类放在这儿，它们的“聪明”体现在其非常快速的变异，从而适应环境的变化.适应能力最强-古细菌类：很多古细菌生存在极端环境中，比如极端嗜热菌可以生存在250度高温的火山口环境，极端嗜酸菌能生活在pH值1以下的环境中，极端嗜碱菌多数生活在pH值11.5以上环境中.最团结协作-病毒类：它们往往“集团作战”（因为其繁殖方式），对人类和其他动物带来很多灾难.。